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发布时间：2025-04-01 浏览次数：
一、实验原理
CCK-8试剂中含有水溶性四氮唑盐(WST-8)，在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下，WST-8可被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒(formazan)染料。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以通过测定光密度(OD值)来评估细胞的存活率和增殖能力。
二、实验步骤
制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞，用含血清培养基重悬后，通过血细胞计数板计数，并稀释至适当的浓度(通常为5×10^3~5×10^4个/ml)。
接种细胞：将稀释后的细胞悬液接种至96孔板中，每孔100μl，并设置不同浓度组和复孔。同时，设立空白组和对照组以进行对比分析。注意接种细胞数要适中，过低或过高的密度都会影响实验结果的准确性。对于标准96孔板，贴壁细胞每孔最少需接种1000个细胞(100μl培养基)，白细胞则每孔接种量不低于2500个细胞(100μl培养基)。
预培养：将接种好的培养板放入培养箱中，预培养24小时左右(37℃，5%CO2)，使细胞达到指数期。
加入待测物质(如有需要)：向各孔中加入不同浓度的药物或化学试剂等待测物质，并继续孵育一定时间。孵育时间应根据待测物质性质和细胞敏感性来定。
加入CCK-8溶液：弃掉孔内原有培养基，向每孔中加入新配制的含有终体积1/10 CCK-8溶液的完全培养基(即每孔加入10μl CCK-8溶液)，轻轻晃动培养板以混匀。注意避免产生气泡，以免影响吸光度读数。
再次孵育：将培养板放回培养箱中，继续孵育1至4小时。孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异，需要自己摸索。最佳OD值控制在1~2之间较合适。
测定吸光度：使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度(OD值)。若样品为高浑浊的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450~490nm，参比波长600~650nm。
三、实验结果计算
细胞增殖率：(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。
细胞活力：(A加药-A空白)/(A0加药-A空白)×100%。其中，A加药为具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A空白为具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0加药为具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
四、注意事项
实验过程中要避免产生气泡，气泡会影响OD值的读数。
CCK-8试剂的添加量要适量，过多或过少都会影响实验结果。
培养时间要适当，过长或过短的培养时间都可能导致实验结果的偏差。
测定吸光度时，要确保酶标仪的校准准确，以获得可靠的实验数据。
若待测物质具有氧化性或还原性，应在加入CCK-8之前更换新鲜培养基以去除其影响。
CCK-8检测细胞活性实验具有操作简便、结果快速、灵敏度高等优点，广泛应用于药物筛选、细胞毒性测试和生物医学研究中。