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发布时间：2025-09-11 浏览次数：
一、模型构建原理
皮肤是人体最大的物理屏障，创伤(如切割、烧伤、擦伤)会破坏皮肤的完整性，导致屏障功能丧失。此时，环境中的致病菌(如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等)可通过伤口侵入皮下组织，引发局部炎症反应(如红肿、热痛、化脓)。若感染未得到有效控制，细菌可能进一步扩散，导致全身性感染(如败血症)。
小鼠皮肤结构与人类皮肤具有高度相似性(均由表皮、真皮、皮下脂肪层构成)，且免疫系统功能与人类存在一定同源性，因此通过 “制造标准化伤口 + 定量接种致病菌” 的方式，可精准模拟人类皮肤创伤后感染的病理生理过程，包括：
1.局部炎症细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)浸润;
2.细菌在创面定植、繁殖并破坏周围组织;
3.创面愈合延迟(感染抑制成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成);
4.严重时出现全身炎症反应(如体温升高、体重下降)。
二、实验材料
1. 实验动物
小鼠品系：常用 SPF 级(无特定病原体)小鼠，如 C57BL/6(近交系，遗传背景稳定，适合机制研究)、BALB/c(近交系，免疫反应敏感)、ICR(远交系，价格低廉，适合初筛实验)。
周龄与性别：通常选择 6-8 周龄雄性小鼠(避免雌性小鼠发情周期对免疫状态的影响，减少个体差异)，体重 20-25g。
饲养条件：SPF 级动物房，温度 22-25℃，湿度 40%-60%，12h 光暗循环，自由摄食饮水，适应性饲养 1 周后开始实验。
2. 致病菌与培养试剂
常见致病菌：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)：人类皮肤感染最常见致病菌，推荐菌株如 ATCC 25923(标准菌株)、MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，如 ATCC 43300，模拟耐药菌感染);
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)：烧伤、慢性创面感染常见菌，推荐菌株如 ATCC 27853;
其他：如表皮葡萄球菌(条件致病菌)、大肠杆菌(继发性感染菌)。
培养试剂：LB 培养基(培养细菌)、TSB 培养基(细菌扩大培养)、磷酸盐缓冲液(PBS，稀释细菌、清洗伤口)、革兰氏染色液(鉴定细菌)。
三、模型构建方法(以 “全层皮肤切割伤 + 金黄色葡萄球菌感染” 为例)
1. 实验前准备
细菌制备：提前 18-24h 将金黄色葡萄球菌接种于 LB 培养基，37℃摇床(200rpm)培养至对数生长期(OD600≈0.6-0.8);离心(3000rpm，10min)收集细菌，用 PBS 重悬并调整浓度至 1×10⁶-1×10⁸CFU/mL(根据实验需求调整，浓度过高易导致全身感染死亡，过低易自愈)，备用。
动物准备：实验前 1 天给小鼠背部剃毛(用电动剃毛器或脱毛膏)，面积约 2cm×2cm;实验当天用碘伏 + 75% 乙醇对剃毛区皮肤消毒，转移至超净工作台。
2. 麻醉与伤口制造
麻醉：腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(50mg/kg)，待小鼠角膜反射消失、四肢松弛后，将其俯卧固定于无菌手术台。
制造全层皮肤伤口：用无菌手术刀在小鼠背部正中线右侧 1cm 处，切割一个 “圆形或方形” 全层皮肤缺损伤口(直径 8-10mm，深度至皮下脂肪层，避免损伤肌肉层);用无菌纱布轻压止血(约 1-2min，若出血较多可缝合止血)。
3. 致病菌接种与术后护理
接种细菌：用无菌移液器吸取 100μL 制备好的细菌悬液(浓度 1×10⁷CFU/mL)，均匀滴加于伤口表面，确保细菌液完全覆盖创面;待液体吸收后(约 5min)，用无菌纱布轻轻覆盖伤口(可选，避免小鼠抓挠)。
术后护理：将小鼠置于温暖复苏箱中，待其自主苏醒后转移至 SPF 级笼具;术后 24h 内腹腔注射丁丙诺啡镇痛，自由摄食饮水，每日观察小鼠状态。
4. 模型构建周期
急性感染模型：接种后 1-3 天(创面出现明显红肿、渗液，细菌大量定植);
慢性感染模型：接种后 7-14 天(创面持续化脓、愈合延迟，形成慢性炎症)。
四、模型评价指标
模型评价需从宏观表现、细菌学、组织病理学、分子生物学四个维度综合判断，确保模型构建成功且稳定。
评价维度具体指标检测方法与判断标准
宏观表现：
1. 一般状态
2. 创面外观
3. 伤口愈合率
细菌学指标
1. 创面细菌定植量
2. 细菌扩散情况
组织病理学
1. 炎症细胞浸润
2. 组织损伤程度
3. 肉芽组织形成
分子生物学
1. 炎症因子表达
2. 抗菌相关蛋白表达
五、关键注意事项
1. 无菌操作与生物安全
所有手术器械、创面处理过程需在超净工作台中进行，避免杂菌污染(否则会干扰实验结果);
处理致病菌(如 MRSA)时需在生物安全柜中操作，实验后器械用 121℃高压灭菌 30min，废液用含氯消毒剂处理，避免实验室感染。
2. 伤口标准化与一致性
伤口大小、深度需严格统一(推荐用定制模具辅助切割)，避免因伤口差异导致感染程度不均;
细菌接种量需精准(用 OD 值校准 + 平板计数验证)，同一批次实验小鼠的接种浓度、体积必须一致(如均为 100μL 1×10⁷CFU/mL)。
3. 动物伦理与 3R 原则
实验需通过机构动物伦理委员会批准，严格遵循 “减少(Reduction)、替代(Replacement)、优化(Refinement)” 原则;
术后及时镇痛(如丁丙诺啡)，若小鼠出现严重痛苦(如持续萎靡、体重下降>20%、全身化脓)，需及时实施安乐死(符合动物伦理要求)。
4. 排除干扰因素
小鼠品系差异：不同品系小鼠的免疫功能不同(如 C57BL/6 小鼠对金黄色葡萄球菌抵抗力较强，BALB/c 较敏感)，实验需固定品系;
性别与年龄：避免使用妊娠小鼠或老年小鼠(免疫功能异常)，推荐 6-8 周龄雄性小鼠;
环境因素：动物房温度、湿度需稳定，避免因环境应激影响小鼠免疫状态，进而干扰感染进程。
5. 模型稳定性验证
每批次实验需设置对照组：包括 “正常伤口组”(仅造伤，不接种细菌)和 “假感染组”(造伤后接种 PBS)，通过对比确认感染的特异性;
若需长期实验(如慢性感染)，需定期检测创面细菌定植量，确保感染持续(避免细菌被小鼠自身免疫系统清除导致模型失效)。