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BCA(Bicinchoninic acid)法是一种基于铜离子还原反应的蛋白浓度检测技术。其核心原理包含两个关键反应步骤：

还原反应：在碱性环境中，蛋白质分子中的肽键将二价铜离子(Cu²⁺)还原为一价铜离子(Cu⁺)，这一过程被称为双缩脲反应(biuret reaction)。

显色反应：生成的Cu⁺与BCA试剂(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)特异性结合，两分子BCA螯合一分子Cu⁺，形成稳定的紫色水溶性复合物。

该复合物在562nm波长处具有最大吸收峰，其吸光度与蛋白浓度在20-2000μg/ml范围内呈良好线性关系，通过比色法即可准确测定蛋白浓度。

二、BCA试剂盒的核心优势

1）性能特点

高效快速：完整检测流程仅需45分钟，比传统Lowry法快4倍

超高灵敏度：

检测下限：25μg/ml(常规型)，增强型可达10μg/ml

最小检测量：0.5μg(微量检测仅需1-20μl样品)

抗干扰能力强：

耐受5% SDS

耐受5% Triton X-100

耐受5% Tween系列去垢剂

宽线性范围：20-2000μg/ml(增强型可达10-2000μg/ml)

重复性好：不同蛋白质检测的变异系数显著小于考马斯亮蓝法

2）操作便利性

兼容96孔板检测体系，大幅节省试剂用量

工作液配制简单(A:B=50:1)

结果稳定性好，显色复合物可稳定数小时

三、关键注意事项与优化方案

1）干扰物质管理

还原剂：

DTT、β-巯基乙醇需<1mM

去垢剂：

SDS<0.1%

Triton X-100<0.5%

其他干扰物：

螯合剂(EDTA/EGTA)需避免

高浓度脂类/核酸建议氯仿抽提预处理

2）操作规范

温度控制：

孵育温度波动应控制在±2℃内

最佳反应温度37℃(不同厂家可能略有差异)

比色系统维护：

比色皿需彻底清洁，避免洗涤剂残留

建议使用专用比色皿避免交叉污染

标准曲线：

必须随实验同步制作

BSA标准品推荐浓度梯度：0, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1500μg/ml

3）试剂保存

原液：避光4℃保存(有效期12个月)

工作液：现配现用

蛋白标准品：-20℃长期保存

结晶处理：4℃保存出现结晶时，37℃温浴溶解不影响效果

四、BCA法与其他蛋白定量方法对比

五、特殊应用场景解决方案

1）高背景样品：

建议改用Bradford法

或进行样品预处理(透析/沉淀)

2）微量样品检测：

选用增强型BCA试剂盒(检测下限0.2μg)

采用微量比色皿(<50μl体系)

3）高通量筛选：

推荐96孔板操作模式

使用酶标仪读数(562nm)

BCA法因其优异的灵敏度、抗干扰能力和操作简便性，已成为目前实验室最主流的蛋白定量方法之一，特别适用于含去垢剂的细胞裂解液样本检测。但对于特殊样本(如含高浓度还原剂或脂类)，建议根据干扰物类型选择替代方案。