当前位置：
发布时间：2025-06-17 浏览次数：
核心原理
1. 荧光标记： 在PCR反应体系中加入荧光报告分子。荧光信号的强度与PCR产物的量成正比。
2. 实时监测： 在PCR循环的特定阶段(通常是在延伸结束时)检测荧光信号。仪器(实时荧光定量PCR仪)在每次循环后都会读取荧光值。
3. 扩增曲线： 仪器将荧光信号绘制成一条曲线，称为扩增曲线。这条曲线通常分为三个阶段：
基线期： 早期循环，荧光信号低于检测阈值，增长缓慢。
指数增长期： PCR产物以指数方式增长，荧光信号显著增加。这是定量的关键阶段。
平台期： 反应组分耗尽，产物增长停滞，荧光信号不再显著增加。
4. 阈值与Ct值：
在指数增长期内设置一个阈值线(通常比基线荧光高几个标准差)。
Ct值(Threshold Cycle) 或 Cq值(Quantification Cycle)：指PCR扩增产物达到设定的阈值线时所经历的循环数。这是qPCR定量的核心参数。
关键关系： 起始模板量越高，达到荧光阈值所需的循环数越少(Ct值越小)。起始模板量越低，Ct值越大。 Ct值与起始模板量的对数呈线性关系。
主要荧光检测方法
1. 非特异性染料法(如SYBR Green I)：
原理： 染料特异性地结合到双链DNA的小沟中，结合后发出强荧光。只要有双链DNA产物形成，荧光就会增强。
优点： 简单、成本低、灵活(只需设计引物)。
缺点： 非特异性，会结合任何双链DNA(包括引物二聚体)，可能产生假阳性信号。需要严格的熔解曲线分析来确认产物特异性。
2. 水解探针法(如TaqMan探针)：
原理： 使用一条序列特异性的寡核苷酸探针，其5'端标记荧光报告基团(Reporter, R)，3'端标记荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整时，R的荧光被Q淬灭。在PCR延伸过程中，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针水解，使R与Q分离，从而释放荧光信号。
优点： 特异性高(需要探针和引物都结合正确才能产生信号)，多重检测能力强(使用不同颜色的报告基团)。
缺点： 成本较高(需要合成探针)，探针设计比引物设计更复杂。
3. 分子信标法： 探针设计成茎环结构，环部与靶序列互补。结合靶序列后，茎环打开，报告基团与淬灭基团分离产生荧光。特异性高，背景低。
4. 杂交探针法(如FRET探针)： 使用两条相邻的探针，一条标记供体荧光基团，一条标记受体荧光基团。当两条探针同时结合到靶序列上时，发生荧光共振能量转移(FRET)，受体荧光基团发光。特异性高，适合熔解曲线分析进行SNP分型。
定量类型
1. 绝对定量：
目标： 确定样品中目标核酸的绝对拷贝数或浓度(如每微升多少个拷贝)。
方法： 使用已知浓度的标准品(通常是含有目标序列的质粒DNA或体外转录的RNA)制作标准曲线。将待测样品的Ct值与标准曲线进行比较，计算出绝对量。
应用： 病原体载量检测(如病毒拷贝数)、转基因成分定量、基因拷贝数变异分析等。
2. 相对定量：
目标： 确定目标基因在不同样品(如处理组 vs 对照组)之间的表达差异倍数(如处理组是对照组的2.5倍)。
方法： 需要同时检测一个或多个稳定的内参基因(Housekeeping Gene) 作为参照(如GAPDH, β-actin, 18S rRNA)。通过比较目标基因与内参基因的表达变化(常用ΔΔCt法计算)来消除样品间加样量、RNA质量、反转录效率等差异带来的误差。
应用： 基因表达差异分析(mRNA水平)、microRNA表达分析等。
关键应用领域
基因表达分析： 研究不同条件下(疾病、发育、药物处理等)特定基因mRNA的表达水平变化(相对定量)。
病原体检测与定量： 快速、灵敏、定量地检测病毒(如HIV, HBV, HCV, SARS-CoV-2)、细菌、寄生虫等的载量(绝对定量)，用于诊断、疗效监测和流行病学研究。
转基因检测： 定量检测食品、饲料或环境样品中转基因生物(GMO)的含量(绝对定量)。
SNP分型与基因分型： 利用特定的探针设计(如TaqMan SNP assays)或熔解曲线分析进行单核苷酸多态性检测和基因型鉴定。
microRNA分析： 检测微小RNA的表达水平(通常需要特殊的茎环引物进行反转录)。
基因拷贝数变异(CNV)分析： 通过相对定量(与单拷贝基因比较)检测基因组片段的扩增或缺失。
药物开发与药效研究： 评估药物对基因表达的影响。
食品安全与环境监测： 检测食源性致病菌、污染物指示菌等。
主要优势
定量能力： 提供精确的起始模板量信息(绝对或相对)。
高灵敏度： 可检测极低拷贝数的模板(甚至单拷贝)。
高特异性： 特别是探针法，特异性远高于传统PCR。
宽动态范围： 可覆盖多个数量级(通常5-8个log)的浓度变化。
高通量： 96孔板或384孔板格式，可同时处理大量样品。
快速： 无需进行凝胶电泳等后处理步骤，闭管操作减少污染风险。
自动化： 仪器自动完成扩增、检测和数据分析。
可重复性： 实验操作规范时，结果稳定可靠。
重要注意事项与挑战
引物和探针设计： 至关重要，直接影响反应的特异性和效率。需要专业软件设计和优化。
扩增效率： 理想情况下应为100%(每循环产物翻倍)。效率偏离100%(通常在90%-110%可接受)会影响定量的准确性，需要在分析时进行效率校正(尤其在相对定量中)。
内参基因的选择(相对定量)： 内参基因必须在比较的所有样品组中稳定表达。选择不当会导致错误结论。需要预先验证其稳定性。
抑制物： 样品中可能存在抑制PCR反应的物质(如血液中的血红素、植物中的多酚多糖)，需要进行样品纯化或稀释。
污染控制： 极其关键，尤其是检测低拷贝模板时。严格的实验室分区、使用带滤芯的枪头、UNG酶防污染系统等都是常用措施。
数据分析： 阈值设定、基线调整、标准曲线制作、相对定量计算(如ΔΔCt法)都需要正确理解和操作。
熔解曲线分析(SYBR Green法)： 必须进行，以确认扩增产物是单一特异性的，没有引物二聚体或非特异性产物。
实验重复： 建议设置技术重复(同一份样品做多孔)和生物学重复(不同来源的样品)，以提高结果的可靠性和统计效力。
标准化与报告规范： 为促进结果的可比性和可重复性，强烈建议遵循MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南。
总结
定量PCR(qPCR)是分子生物学和诊断领域的一项革命性技术，它通过实时监测PCR过程中的荧光信号，实现了对核酸模板的精确定量(绝对或相对)。其高灵敏度、特异性、通量和定量能力使其在基因表达分析、病原体检测、基因分型等众多领域发挥着不可替代的核心作用。然而，要获得可靠准确的结果，必须严格把控实验设计(引物/探针、对照设置)、操作规范(防污染、重复设置)和数据分析(阈值、效率、内参)等关键环节。